农业农村部公告 第172号（猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法）

为确保兽用生物制品质量安全，防止非洲猪瘟病毒污染相关制品，根据《中华人民共和国动物防疫法》《重大动物疫情应急条例》《兽药管理条例》等法律法规规定，自2019年5月25日起，各兽用生物制品生产企业（以下简称“生产企业”）应对兽用生物制品生产过程中使用的毒种、原辅材料、半成品、成品等全面开展非洲猪瘟病毒核酸检测，并做好检测结果报送和后续处置工作。现就有关事项公告如下。
 
一、生产企业开展非洲猪瘟病毒核酸检测至少应包括以下范围：（一）猪用及采用猪源原辅材料制备的生物制品成品及半成品；（二）猪源毒种；（三）猪源细胞及相关制品生产用细胞；（四）其他猪源原辅材料（如组织、血清、胰酶等）。
 
二、样品的取样和处理、核酸提取、检测，按照猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法（见附件）或我部批准的商品化检测试剂盒说明书进行。
 
三、对猪源生物材料和毒种的检测结果应记录在相应产品的批记录中，由生产企业归档留存；对猪用生物制品的检测结果，除需记入批记录外，还应随批签发报告报中国兽医药品监察所。
 
四、一旦检出非洲猪瘟病毒核酸阳性样品，生产企业应立即停止生产，销毁该批成品、半成品、毒种、原辅材料，进行彻底消毒，并在24小时内报生产企业所在地省级畜牧兽医行政管理部门；省级畜牧兽医行政管理部门应及时组织开展追溯调查，并及时报农业农村部畜牧兽医局，同时抄报中国兽医药品监察所。对检出的阳性样品及相关产品、原辅材料、细胞、毒种等风险物品，生产企业要按要求及时进行无害化处理；经彻底消毒并对换批的毒种、原辅材料进行非洲猪瘟病毒核酸检测合格后，生产企业方可恢复生产。对在追溯调查中发现的有关情况，省级畜牧兽医行政管理部门要按规定进行严格处置。
 
五、生产销售污染非洲猪瘟病毒的兽用疫苗的，应按《兽药管理条例》第五十六条“生产、经营假、劣兽药”情节严重进行从重处罚，吊销兽药生产许可证和经营许可证；因生产销售污染非洲猪瘟病毒的兽用疫苗造成疫病传播的，还应按有关法律规定依法追究刑事责任；给他人造成损失的，依法承担赔偿责任。
 
    附件：猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法
 
农业农村部
2019年5月13日
附件
   猪用生物制品及相关猪源原辅材料中
  非洲猪瘟病毒核酸检测方法
 
1  适用范围
1.1猪用及采用猪源原辅材料制备的生物制品成品及半成品。
1.2猪源毒种。
1.3 猪源细胞及相关制品生产用细胞。
1.4其他猪源原辅材料（如组织、血清、胰酶衍生物等）。
2  取样和处理
2.1 疫苗
2.1.1  活疫苗  取至少2瓶样品，按瓶签注明头份用适宜稀释液分别稀释成10头份/0.2ml，等量混合，取混合液进行核酸提取。
2.1.2  灭活疫苗  取至少2瓶样品，等量混合后进行以下处理。
2.1.2.1 油佐剂灭活疫苗  取36 ml混合疫苗，加入正戊醇4.0 ml，充分振荡混合1分钟，2～8℃冰箱静置不少于60分钟，直至油相和水相分离。取水相进行核酸提取。
2.1.2.2 水性佐剂灭活疫苗
2.1.2.2.1铝胶佐剂灭活疫苗  取混合疫苗5.0 ml，摇匀，加入0.25 g解离剂CPG-odn（人工合成的寡聚核苷酸），放入摇床（200 r/min）37℃解离1小时，5000 r/min离心10分钟，取上清液进行核酸提取。
2.1.2.2.2其他水性佐剂灭活疫苗  直接取混合样品进行核酸提取。
2.2 其他生物制品和半成品冻干类制品，按活疫苗进行取样和处理；液体制品及半成品，取至少2份（瓶）样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
2.3 猪源毒种  取至少2支毒种。冻干毒种，按冻干前体积复溶后等量混合，取混合液进行核酸提取；非冻干毒种，等量混合后直接取混合液进行核酸提取。
2.4 猪源细胞  除另有规定外，取至少2瓶细胞浓度不少于10^7.0个细胞/ml的细胞悬液进行核酸提取。
2.5 其他猪源原辅材料
2.5.1 猪组织  每种组织，分别取样和处理。取不少于2.0 g组织，研磨后用5倍体积灭菌PBS悬浮，70℃灭活30分钟，4℃下以2000～3000 g离心10分钟，取上清液进行核酸提取。
2.5.2 猪血清  每批血清取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
2.5.3 猪胰酶  干粉状胰酶，取至少2份样品，根据使用情况分别配制成不低于2.5%浓度的溶液，等量混合，取混合液进行核酸提取；液体胰酶，取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
2.5.4 其他猪源衍生物  固体、液体或干粉状猪源衍生物，可分别按组织、血清或干粉状胰酶的方法进行取样和样品处理。
3  核酸提取
3.1 试剂和器材
3.1.1 试剂  根据核酸提取方法确定，如氯仿、异丙醇、无水乙醇、0.1 mol/l 柠檬酸钠（含10%乙醇）、75%乙醇等。
3.1.2 仪器  核酸含量测定仪；常温台式离心机；旋涡振荡器；水浴锅；微量移液器1套（最大量程分别为10 µl、100 µl、200 µl、1000 µl）。
3.1.3 耗材  1.5 ml带盖离心管、无菌吸头（0～10 µl、0～200 µl、100～1000 µl）、一次性乳胶手套。
3.2  操作程序（TRIZOL法），也可以选择其他等效核酸提取方法提取样品中的DNA。
3.2.1 取样品250 µl，加入750 µl Trizol，颠倒混匀，室温放置5分钟。
3.2.2 加入200 µl氯仿，充分混匀，室温放置10 分钟，4℃下以12000 g离心15 分钟。
3.2.3 弃去上清液，加入220 µl无水乙醇，颠倒混合，15～30℃放置2～3分钟，2～8℃以2000 g离心5分钟，沉淀物为DNA。
3.2.4 弃去上清液，加入含10%乙醇的0.1 mol/l 柠檬酸钠750 µl洗涤DNA，15～30℃放置30分钟，2～8℃以2000 g离心5分钟。重复一次。
3.2.5 加入75%乙醇1.2 ml，重悬DNA沉淀，15～30℃放置20分钟，4℃2000 g离心5分钟。可重复一次，充分洗涤DNA沉淀。
3.2.6 弃去上清液，敞开离心管管口，在空气中干燥5～10分钟，加入30～50 μl的无核酸酶灭菌水溶解DNA，－20℃以下保存备用。
3.3  注意事项
3.3.1核酸提取试剂具有腐蚀和强变性能力，应做好个人防护，佩戴手套、口罩和护目镜，防止液体飞溅到皮肤和眼睛。
3.3.2后续的核酸检测敏感性很高，要防止样品之间相互污染，最好使用带滤芯的枪头，且每次吸取取液体时均需更换枪头。
3.3.3为防止核苷酸降解，应避免核酸酶污染，使用的耗材均需无核酸酶。
3.3.4做好剩余样品的无害化处理及操作台面的消毒处理。剩余样品可通过高压灭菌或煮沸处理，也可放在1%卫可或2%氢氧化钠消毒液中浸泡处理，操作台面使用1%卫可擦拭。
3.3.5提取后的DNA样品要用锡箔纸封存，取样时应用枪头直接刺破锡箔纸取样，防止污染。
4  检测
下列两种方法可任选其一。
4.1  实时荧光定量PCR检测法
4.1.1 试剂和器材
4.1.1.1 试剂
4.1.1.1.1 荧光定量PCR试剂  本操作中以Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays kit为例，也可选用其他荧光定量PCR试剂。
4.1.1.1.2 扩增引物及探针
扩增引物：
ASF-05-Zsak-1466F（10 µmol/ L）：5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'
ASF-05-Zsak-1528R（10 µmol/ L）：5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'
探针ASF-05-Zsak-1486prob (10 µmol/ L)：5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'
4.1.1.1.3  无核酸酶的灭菌水  PCR级别。
4.1.1.2  仪器  荧光定量PCR仪；微量移液器1套（最大量程分别为10 µl、100 µl、200 µl、1000 µl）。
4.1.1.3 耗材  1.5 ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、荧光定量PCR 96孔板、0.1 ml荧光PCR八连管、无菌吸头（0～10 µl、0～200 µl、100～1000 µl）、一次性乳胶手套。
4.1.2  操作程序
4.1.2.1 样品DNA制备  按照前述方法进行核酸提取。
4.1.2.2 反应体系的配制  配制比样品数量至少多4个的反应体系，同时设置强阳性、弱阳性和阴性对照。在强阳性和弱阳性对照反应管中分别加入含有非洲猪瘟P72基因的标准质粒DNA各3 µl，在阴性对照反应管中加入3µl无核酸酶灭菌水。每个PCR反应管中应包含以下成分：

4.1.2.3  反应程序  将所有待检样品和强阳性、弱阳性、阴性对照反应管放在荧光定量PCR仪中，按照以下程序进行扩增：50℃2分钟，95℃5分钟，95℃15秒，58℃退火延伸1分钟，45个循环（荧光信号收集在此阶段每次循环的退火延伸时进行）。
4.1.2.4  结果判定
4.1.2.4.1  阈值设定  试验操作结束后，确定Ct值。Ct值为每个样品反应管内荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。
4.1.2.4.2  质控标准
对照组的检测结果应符合以下情况，此次检测方为有效：
阴性对照无Ct 值，且无扩增曲线。
强阳性对照的Ct 值应在18～22之间，并出现典型的扩增曲线。弱阳性对照的Ct 值应在33～35之间，并出现典型的扩增曲线。
4.1.2.4.3  判定
阴性：无Ct值，且未出现扩增曲线，判定为样品中无ASFV核酸。
阳性：Ct值≤40，且出现典型的扩增曲线，判定为样品中存在ASFV核酸。
可疑：Ct值>40，且出现典型扩增曲线，判定为可疑，应重检。重检后，Ct值≤40且出现典型扩增曲线者判为阳性，其他情况均判定为阴性。
4.2  普通 PCR检测法
4.2.1  试剂和器材
4.2.1.1  试剂
4.2.1.1.1 PCR试剂  10×PCR缓冲液（含25 mmol/l  Mg²⁺），DNA扩增酶，dNTP预混液。
4.2.1.1.2扩增引物
primer PPA-1（10 μmol/L）：5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3' (上游引物)；
primer PPA-2（10 μmol/L）：5'- CCCTGAATCGGAGCATCCT-3' (下游引物)。
4.2.1.1.3  DNA分子量标准品  DL500。
4.2.1.1.4  TAE电泳缓冲液  配制方法见《电泳液标准配制流程》。
4.2.1.1.5  1%琼脂糖凝胶板  在100 ml 1×TAE缓冲液中加入1g琼脂糖，加热融化，加入5.0 μl (10 mg/ml)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度达5.0 mm左右。根据样品数量选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔)，放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。
4.2.1.2 仪器  DNA扩增仪，稳压稳流电泳仪，水平电泳槽，凝胶成相系统（或紫外透射仪），微量移液器1套。
4.2.1.3 耗材  1.5 ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、无菌吸头（0～10 µl、0～200 µl、100～1000 µl）。
4.2.2 操作程序
4.2.2.1 样品DNA制备  按照前述方法进行核酸提取。
4.2.2.2 反应体系的配制  配制比样品数量至少多3个的反应体系，同时设立阳性和阴性对照。在阳性对照反应管中加入非洲猪瘟P72基因重组质粒2.0 µl，在阴性对照反应管中加入2.0 µl无核酸酶灭菌水。每个PCR反应管中应包含以下成分：

4.2.2.3  反应程序  将所有待检样品及阳性和阴性对照反应管放在PCR仪中，按照以下程序进行扩增：94℃2分钟，94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。4℃保存。
4.2.2.4  PCR扩增产物分析  取PCR扩增产物10 µl，加6×加样缓冲液2.0 µl，混匀，用1.5%琼脂糖凝胶对混合物进行电泳分析，电压120V，电流50 mA，电泳时间30分钟。电泳结束后，用凝胶成像系统拍照，记录检测结果。
4.2.2.5 结果判定
4.2.2.5.1 质控标准
对照组的检测结果应符合以下情况，此次检测方为有效：
阴性对照应不出现257bp的特异性条带。
阳性对照应出现257bp的特异性条带。
4.2.2.5.2 判定
阳性：待检样品出现与阳性对照大小一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性，扩增产物可通过DNA测序进一步确定基因型。
阴性：待检样品未出现与阳性对照大小一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。
4.3  注意事项
4.3.1检测过程中应遵循PCR实验分区原则，即应区分试剂配制区、样本处理区、核酸扩增区。
4.3.2应避免在含有靶序列的区域中使用引物，防止污染靶序列。